マルチプレックスアッセイ：より迅速な答えと新たな課題

Luminex xMAPプラットフォームによるマルチプレックスアッセイを用いることで、大量のサンプルを必要とするラジオアイソトープを用いたリン酸化アッセイやウェスタンブロット、質量スペクトル分析などの従来の手法よりも迅速に細胞シグナル伝達に関する上記の疑問に対して答えが得られます。

マルチプレックスイムノアッセイでは、以下の事を実施できるため、細胞内の情報伝達システムに対する理解が進みます。

• 一滴のサンプルで、特定のシグナル伝達経路における複数のトータルタンパク質またはリン酸化タンパク質を測定
• 複数の経路でのリン酸化部位を同時測定
• 微量のサンプルで必要な解析を全て実施

しかし、マルチプレックスアッセイにはいくつかの課題もあります－以下の理由により、Luminexプラットフォームに適したリン酸化特異的抗体の選定には多大な労力を要します。

• ウェスタンブロットでは通常変性タンパク質を認識するが、マルチプレックスアッセイでは天然型タンパク質の立体構造が必要
• バッファーとリン酸化タンパク質の複雑な相互作用
• マルチプレックスアッセイ時のマトリックス効果及び抗体間の反応

その結果、以下のような問題が生じます。

• 認識できるターゲットが限定されるため、十分なパスウェイ解析ができない
• 定量的ではなく、定性的な結果
• 特定のアナライトの各リン酸化部位及びトータルタンパク質を解析するのに異なるウェルが必要

 

MILLIPLEX EpiQuantテクノロジーを用いた効果的なマルチプレックスアッセイ

以上のマルチプレックスアッセイに関する課題を解決するため、ミリポアは、MILLIPLEX MAPセルシグナリングキット及びMAPmateに加え、Luminex社の技術をベースとした手法を用いて、シグナル伝達経路及び細胞表現型におけるリン酸化状態の変化をプロファイリングすることができる、新たなMILLIPLEX EpiQuantセルシグナリング製品をラインナップ致しました。Epitome Biosystems社のEpi Tag™テクノロジーを基にしたMILLIPLEX EpiQuant製品ラインナップは、定量的イムノアッセイの設計及び実施において大きな前進を意味します。

EpiQuantテクノロジーでは、タンパク質中に存在するユニークな連続直鎖状配列を認識するための計算アルゴリズムを用いて、これらの特異的配列に対する抗体を作成します。サンプルのタンパクが分解されると、これらのEpiQuant部位を持つペプチド（上記赤及び青/紫）が遊離されるため、EpiQuant抗体を用いてトータルタンパク質存在量（水色の抗体）と部位特異的リン酸化（薄紫の抗体）を、ペプチドレベルで同時に測定することができます。その後、これらのペプチドを用いて標準曲線を生成することで、pmolレベルの感度での定量測定が可能となります。

  EpiQuantのユニークなサンプル処理でより良質なデータを取得

EpiQuantサンプル処理プロトコールのユニークな特徴は、タンパク質サンプルを断片化または分解することです。このプロセスにはいくつかの利点があります。

• タンパク質間相互作用を阻止します。
• 合成ペプチドを定量的なスタンダードとして用いることができます。
• 抗体の特異性を小型の直鎖ペプチド配列にまで制限できます。
• 他のタンパク質における類似のペプチド配列との交差反応性を予測し、回避できます。
• サンプルの残留酵素活性（ホスファターゼ及びプロテアーゼなど）を抑えます。

  MILLIPLEX EpiQuantアナライトの生物学的検証

MILLIPLEX MAP EpiQuantアナライトは全て、生物学的関連性及び特異性に関して検証されています。

上の実験では、A431細胞とJurkat細胞を培養し、血清欠乏状態にして、H2O2で刺激しました。溶解・断片化処理の後、MILLIPLEX EpiQuantホスホチロシンセルシグナリングパネル1を用いて、サンプルのトータルRafとリン酸化Rafを分析しました。ペプチド標準曲線を用いて平均蛍光強度（MFI）をモル濃度に変換しました。